Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang Farmasi

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) DALAM BIDANG FARMASI

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya (Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979; Hamilton dan Sewell, 1982; Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu antara lain:

·         Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

·         Mudah melaksanakannya

·         Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

·         Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis

·         Resolusi yang baik

·         Dapat digunakan bermacam-macam detektor

·         Kolom dapat digunakan kembali

·         mudah melakukan "sample recovery"

A.    Jenis-jenis kromatografi

1.      Kromatografi padatan cair (LSC)

Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC) adalah salah satu bentuk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadati atau dipak dengan partikelpartikel micro or macro particulate or pellicular (berkulit tipis 37 -44 µ). Sebagian besar dari KCKT sekarang ini dibuat untuk mencapai partikel-partikel microparticulate lebih kecil dari 20µ . Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat yang mudah larut dalam pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama sangat kuat untuk pemisahan isomer-isomer.

2.      Kromatografi partisi

Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi cair (LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung pada kromatografi gas (GC). Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC) Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan lama, telah dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan secara kimia dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography). BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari KCKT. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase diam lebih polar dari fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada fase diam.

3.      Kromatografi penukar ion (IEC)

Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah. Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal untuk pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat dipakai untuk keduanya kation dan anion.

4.      Kromatografi eksklusi

Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn jaringan dan ditahan dalam fase gerak yang menggenang (stagnat mobile phase). Molekulmolekul yang lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan. Kromatografi eksklusi rnernpunyai banyak nama, yang paling umum disebut permeasi gel (GPC) dan filtrasi gel. Apapun namanya, mekanismenya tetap sama. Dalam bidang biologi, Sephadex, suatu Cross-linked dextran gel, telah digunakan secara luas, hanya pengepak keras dan semi keras (polistiren, silika, glass) yang digunakan dalam KCKT. Dextran gel lunak tidak dapat menahan kinerja diatas 1 atau 2 atmosfer. Tenik ini dikembangkan untuk analisis polimer-polimer dan bahan-bahan biologi, terutama digunakan untuk rnolekul-molekul kecil.

5.      Kromatografi pasangan ion (IPC)

Kromatogtafi pasangan ion sebagai penyesuaian terhadap KCKT termasuk baru, pemakaian pertama sekali pada pertengahan tahun 1970. Diterimanya IPC sebagai metode baru KCKT merupakan hasil kerja Schill dan kawan-kawan dan dari beberapa keuntungan yang unik. Kadang-kadang IPC disebut juga kromatografi ekstraksi, kromatografi dengan suatu cairan penukar ion dan paired ion chromatography (PIC). Setiap teknik-teknik ini mempunyai dasar yang sama. Popularitas IPC muncul terutama sekali dari keterbatasan IEC dan dari sukanya menangani sampel-sampel tertentu dengan metode-metode LC lainnya (seperti senyawa yang sangat polar, senyawa yang terionisasi secara kompleks dan senyawa basa kuat).

IPC dapat dilaksanakan dalam dua tipe yaitu fase normal dan fase balik. Fase diam dari rase balik IPC dapat terdiri dari suatu pengepak silika yang disilanisasi (misalnya C8 atau C18 Bonded Phase) atau dari suatu pengepak yang diperoleh secara mekanik, fase organik yang tidak dapat bercampur dengan air seperti 1 pentanol. Fase diam yang dipakai adalah Cs atau CIS BPC Packing. Fase gerak terdiri dari suatu larutan bufer (ditambah suatu kosolven organik seperti metanol atau asetonitril untuk pemisahan fase terikat) dan suatu penambahan ion tanding,yang muatannya berlawanan dengan molekul sampel. Sebagai contoh, untuk pemisahan suatu kelompok asam-asam karboksilat menggunakan suatu fase gerak yang dibufer pada pH 7,0 supaya semua senyawasenyawa sampel berada dalam bentuk RCOO (dilambangkan dengan R). Ion tanding dalam hal ini bisa berupa tetrabutyl ammonium ion, BU4N+ (atau TBA+). Dalam hal yang paling sederhana dari IPC, dapat dianggap bahwa sampel dan ion tanding dapat lama hanya dalam fase gerak air, dan pasangan ion yang dibentuk dari ion-ion ini dapat larut hanya dalam fase diam organik.

B.     Penggunaan KCKT dalam Farmasi

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam analisis farrnasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemumian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawasenyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan Kromatografi Gas. Banyak senyawa yang dapat dianalisis, dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat /bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral (chirale Trennphasen) yang mampu menentukan rasemis dan isomer aktif.

Pada Farmakope Indonesia Edisi III Tahun 1979 KCKT belum digunakan sebagai suatu metode analisis baik kualitatif maupun kuantitatif. Padahal di Farmakope negara-negara maju sudah lama digunakan, seperti Farmakope Amerika Edisi 21 (United State of Pharmacopoeia XXI), Farmakope Jerrnan Edisi 10 (Deutches Arzneibuch 10). Pada Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun 1995 sudah digunakan KCKT dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif dan uji kemumian sejumlah 277 (dua ratus tujuh puluh tujuh) obat/bahan obat. Perubahan yang sangat spektakuler dari Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun 1995 ini menunjukkan bahwa Pemerintah Indonesia melalui Departemen Kesehatan Republik Indonesia dan Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan benar-benar telah mengikuti perkembangan dan kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi canggih dalam bidang analisis obat. Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun metoda ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 jenis obat / bahan obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi, waktu analisis cepat.

Dapat dilihat Daftar Obat-obat yang Penetapan Kadamya dengan KCKT yang tercantum dalam Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun 1995. Berikut sembilan daftar obat dari sekian banyak Obat – obat yang Penetapan Kadarnya dengan KCKT (FL Edisi IV) No. Nama Obat /Bahan Obat :

1)      Tablet Asetazolamida

2)      Asetilsistein

3)      Larutan Asetilsistein

4)      Tablet Asetosal

5)      Asam Aminokaproat

6)      Asam Aminosalisilat

7)      Asam Folat

8)      Tablet Asam Folat

9)      Asam Mefenarnat